熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒說明書

產(chǎn)品及特點(diǎn)熒光假單胞菌是一種環(huán)境污染菌。對(duì)于人類是一種罕見的機(jī)會(huì)致病菌。可從傷口、痰、胸水、尿和血液中分離出來，也可從血庫存在中分離出。可在冰箱儲(chǔ)存的血液及血液制品中繁殖，而且自溶后釋放內(nèi)毒素。其內(nèi)毒素的磷脂部分，可導(dǎo)致輸血后不可逆的休克。因此快速靈敏檢測(cè)熒光假單胞菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2.引物經(jīng)過精心優(yōu)化，專一性強(qiáng)，只擴(kuò)增熒光假單胞菌，與其他微生物沒有交叉反應(yīng)。

3.提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。

1.本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

規(guī)格及成分成分 包裝

2×Probe qPCR MagicMix500μL ）

熒光 PCR 專用模板稀釋液1mL

熒光假單胞菌探針法 qPCR

引物-探針混合液150μL ）

熒光假單胞菌探針法 qPCR 陽性

對(duì)照(1×10E7 拷貝/μL)50μL

使用手冊(cè)1 份

運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法一、稀釋PCR 陽性對(duì)照（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

如果做定性實(shí)驗(yàn)，則此步可以跳過。如果做定量實(shí)驗(yàn)，則需要稀釋陽性對(duì)照做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，     只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照（試劑盒提供），充分震蕩 1 分鐘，

得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是樣品制備 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是樣品制備 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管中的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟，

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

過程溫度時(shí)間

預(yù)變性95℃2min

qPCR 反應(yīng)

（40 個(gè)循環(huán)）95℃15sec

55℃30sec（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)）

72℃30sec

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品， 如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，

則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

 產(chǎn)品CAT#:BH5216-51

低溫運(yùn)輸，-20℃保存